Expression protéique in vivo

La surexpression in vivo de protéines à l’aide de cellules procaryotes ou eucaryotes génétiquement modifiées reste le moyen le plus efficace de produire des protéines enrichies en isotopes et convient à l’analyse RMN. Parmi les systèmes d’expression procaryote, l’utilisation de la souche E. coli BL21(DE3) est de loin la plus populaire et la plus rentable. Pour certaines protéines, telles que les protéines membranaires, la surexpression dans E. coli entraîne le dépôt de la protéine recombinante dans les corps d’inclusion sous des formes non solubles, ce qui nécessite ensuite un repliement de la protéine à l’aide de détergents ou de lipides pour obtenir une forme biochimiquement active. Pour améliorer la probabilité d’obtenir des protéines correctement repliées sans avoir besoin de replier, des systèmes d’expression eucaryotes sont utilisés parce que ces types de cellules contiennent des machines moléculaires plus complexes (par exemple, des chaperons pour aider les protéines de repliement pendant l’expression. Les systèmes d’expression eucaryotes les plus populaires utilisent des cellules de levure, d’insecte et de mammifère. Un marquage uniforme et la plupart des types de marquage sélectif sont possibles dans tous les types de cellules.

Quelle que soit la méthode, les protéines ou complexes de taille supérieure à ~25 kDa nécessitent généralement un enrichissement en deutérium afin de simplifier les spectres et de réduire les effets délétères de l’élargissement de la raie associé au couplage dipolaire ¹H. Par conséquent, les milieux minimaux utilisés pour exprimer ces protéines in vivo doivent être formulés à l’aide d’oxyde de deutérium (D₂O). Pour les recherches de grandes protéines ou de complexes, le glucose uniformément deutéré comme source de carbone est nécessaire.

Stable Isotopes for Biomolecular NMR

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❛❛Dans nos mains, le BioExpress 1000 de CIL a fonctionné comme un charme. Le taux de croissance cellulaire et le niveau d’expression protéique correspondaient essentiellement aux résultats obtenus avec le bouillon Luria, et l’efficacité du marquage ¹⁵N était excellente.❜❜

Tero Pihlajamaa, PhD | Institute of Biotechnology, University of Helsinki, Finland

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Celtone Complet

Celtone de CIL est un média entièrement riche le plus vendu pour la production de protéines recombinantes marquées à l’aide d’E. coli. Il est disponible sous forme de poudre pour plus de stabilité (Celtone Base Powder) ou sous forme liquide (Celtone Complete) pour une facilité d’utilisation. Celtone Complete est un milieu prêt à l’emploi contenant 10 g de poudre Celtone par litre de milieu qui ne nécessite pas de dilution ou d’ajustement du pH, et chaque lot est testé pour la stérilité, la croissance cellulaire et l’expression des protéines.

Poudre Celtone

La poudre Celtone de CIL est un additif riche en nutriments marqué pour une utilisation avec un minimum de média. Les milieux en poudre peuvent être utilisés à des concentrations de 1 g à 10 g par litre pour améliorer les rendements d’expression des protéines. Celtone Plus contient plus de deux fois plus de nutriments que le Celtone Base poudre et contient des acides aminés et des peptides uniformément enrichis pour favoriser la croissance des cellules BL21. Des performances vraiment exceptionnelles ont été obtenues en utilisant 10 g de Celtone Plus par litre de support, mais des gains de rendement ont été évidents à des concentrations aussi faibles que 1 g/L.

Otten, R.; Chu, B.; Krewulak, K.D.; et al. 2010. Comprehensive and cost-effective NMR spectroscopy of methyl groups in large proteins. J Am Chem Soc, 132(9), 2952-2960. PMID: 20148553 
Studier, F. W. 2005. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures. Protein Expr Purif, 41(1), 207-234. PMID: 15915565
Tyler, R.C.; Sreenath, H.K.; Singh, S.; et al. 2005. Auto-induction medium for the production of [U-¹⁵N]- and [U-¹³C, U-¹⁵N]-labeled proteins for NMR screening and structure determination. Protein Expr Purif, 40(2), 268-278. PMID: 15766868