in vivo Proteinexpression

Die in vivo Überexpression von Proteinen mit gentechnisch veränderten prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen ist nach wie vor der effizienteste Weg, um isotopenangereichertes Protein herzustellen und für NMR-Analysen geeignet. Unter den prokaryotischen Expressionssystemen ist die Verwendung des Stammes E. coli BL21(DE3) bei weitem das beliebteste und kostengünstigste. Bei einigen Proteinen, wie z. B. Membranproteinen, führt die Überexpression in E. coli dazu, dass das rekombinante Protein in unlöslichen Formen in Einschlusskörperchen abgelagert wird, was dann eine Rückfaltung des Proteins mit Detergenzien oder Lipiden erfordert, um eine biochemisch aktive Form zu erhalten. Um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, richtig gefaltetes Protein zu erhalten, ohne dass eine erneute Faltung erforderlich ist, werden eukaryotische Expressionssysteme verwendet, da diese Zelltypen komplexere Molekülmechanismen (z. B. Chaperone) enthalten, um die Faltungsproteine während der Expression zu unterstützen. Die gängigsten eukaryotischen Expressionssysteme verwenden entweder Hefe-, Insekten- oder Säugetierzellen. Eine einheitliche und die meisten Arten der selektiven Markierung sind in allen Zelltypen möglich.

Unabhängig von der Methode benötigen Proteine oder Komplexe mit einer Größe von mehr als ~25 kDa typischerweise eine Deuteriumanreicherung, um die Spektren zu vereinfachen und die schädlichen Auswirkungen der Linienverbreiterung im Zusammenhang mit der dipolaren ¹H-Kopplung zu reduzieren. Daher müssen minimale Medien, die zur Expression solcher Proteine in vivo verwendet werden, unter Verwendung von Deuteriumoxid (D₂O) formuliert werden. Für die Untersuchung von großen Proteinen oder Komplexen wird gleichmäßig deuterierte Glukose als Kohlenstoffquelle benötigt.

Stable Isotopes for Biomolecular NMR

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❛❛In unseren Händen funktionierte der BioExpress 1000 von CIL wie ein Zauber. Die Zellwachstumsrate und das Proteinexpressionsniveau stimmten im Wesentlichen mit den Ergebnissen überein, die mit Luria-Bouillon erzielt wurden, und die ¹⁵N-Markierungseffizienz war ausgezeichnet.❜❜

Tero Pihlajamaa, PhD | Institute of Biotechnology, University of Helsinki, Finland

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Celtone Komplett

Celtone von CIL ist ein meistverkauftes Full-Rich-Medium für die Herstellung von markierten rekombinanten Proteinen unter Verwendung von E. coli. Es ist als Pulver für zusätzliche Stabilität (Celtone Base Powder) oder als Flüssigkeit (Celtone Complete) für eine einfache Anwendung erhältlich. Celtone Complete ist ein gebrauchsfertiges Medium mit 10 g Celtone-Pulver pro Liter Medium, das keine Verdünnung oder pH-Einstellung erfordert, und jede Charge wird auf Sterilität, Zellwachstum und Proteinexpression getestet.

Celtone Pulver

Celtone Powder von CIL ist ein gekennzeichnetes nährstoffreiches Additiv für die Verwendung mit minimalen Medien. Die pulverförmigen Medien können in Konzentrationen von 1 g bis 10 g pro Liter verwendet werden, um die Proteinexpressionsausbeute zu verbessern. Celtone Plus enthält mehr als doppelt so viele Nährstoffe wie das Celtone Base Pulver und enthält gleichmäßig angereicherte Aminosäuren und Peptide, um das Wachstum von BL21-Zellen zu fördern. Mit 10 g Celtone Plus pro Liter Medium wurde eine wirklich außergewöhnliche Leistung erzielt, aber es waren auch Ertragssteigerungen zu verzeichnen in Konzentrationen von nur 1 g/l.

Otten, R.; Chu, B.; Krewulak, K.D.; et al. 2010. Comprehensive and cost-effective NMR spectroscopy of methyl groups in large proteins. J Am Chem Soc, 132(9), 2952-2960. PMID: 20148553 
Studier, F. W. 2005. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures. Protein Expr Purif, 41(1), 207-234. PMID: 15915565
Tyler, R.C.; Sreenath, H.K.; Singh, S.; et al. 2005. Auto-induction medium for the production of [U-¹⁵N]- and [U-¹³C, U-¹⁵N]-labeled proteins for NMR screening and structure determination. Protein Expr Purif, 40(2), 268-278. PMID: 15766868