Expresión de proteínas in vivo

La sobreexpresión in vivo de proteínas utilizando células procariotas o eucariotas genéticamente modificadas sigue siendo la forma más eficiente de producir proteínas enriquecidas con isótopos y adecuada para el análisis de RMN. Entre los sistemas de expresión procariotas, el uso de la cepa E. coli BL21 (DE3) es, con mucho, el más popular y rentable. Para algunas proteínas, como las proteínas de membrana, la sobreexpresión en E. coli da como resultado que la proteína recombinante se deposite en cuerpos de inclusión en formas no solubles, lo que luego requiere el replegamiento de la proteína usando detergentes o lípidos para obtener una forma bioquímicamente activa. Para mejorar la probabilidad de obtener proteínas correctamente plegadas sin necesidad de replegarse, se utilizan sistemas de expresión eucariota porque estos tipos de células contienen maquinaria molecular más compleja (por ejemplo, chaperonas) para ayudar en las proteínas de plegamiento durante la expresión. Los sistemas de expresión eucariota más populares emplean células de levadura, insectos y mamíferos. El etiquetado uniforme y la mayoría de los tipos de etiquetado selectivo son posibles en todos los tipos de células.

Independientemente del método, las proteínas o complejos de más de ~25 kDa de tamaño típicamente requieren enriquecimiento de deuterio para simplificar los espectros y reducir los efectos nocivos del ensanchamiento de línea asociado con el acoplamiento dipolar de 1H. Por lo tanto, los medios mínimos utilizados para expresar tales proteínas in vivo deben formularse utilizando óxido de deuterio (D2O). Para las investigaciones de proteínas o complejos grandes, se requiere glucosa uniformemente deuterada como fuente de carbono.

Stable Isotopes for Biomolecular NMR

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❛❛En nuestras manos, el BioExpress 1000 de CIL funcionó a las mil maravillas. La tasa de crecimiento celular y el nivel de expresión de proteínas coincidieron esencialmente con los resultados obtenidos con caldo Luria, y la eficiencia de etiquetado de 15N fue excelente.❜❜

Tero Pihlajamaa, PhD | Institute of Biotechnology, University of Helsinki, Finland

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Celtone completo

Celtone de CIL es un medio totalmente rico en ventas para la producción de proteínas recombinantes marcadas utilizando E. coli. Está disponible como polvo para mayor estabilidad (Celtone Base Powder) o como líquido (Celtone Complete) para facilitar su uso. Celtone Complete es un medio listo para usar que contiene 10 g de polvo Celtone por litro de medio que no requiere dilución o ajuste de pH, y cada lote se prueba para determinar su esterilidad, crecimiento celular y expresión de proteínas.

Celtone Polvo

Celtone Powder de CIL es un aditivo rico en nutrientes etiquetado para su uso con medios mínimos. El medio en polvo se puede utilizar en concentraciones de 1 g a 10 g por litro para mejorar los rendimientos de expresión de proteínas. Celtone Plus contiene más del doble de nutrientes que el Celtone Base polvo y contiene aminoácidos y péptidos uniformemente enriquecidos para promover el crecimiento de las células BL21. Se ha logrado un rendimiento verdaderamente excepcional utilizando 10 g de Celtone Plus por litro de soporte, sin embargo, las ganancias en el rendimiento han sido evidentes. a concentraciones tan bajas como 1 g/L.

Preguntas frecuentes

¿Cómo sé qué reactivos de medios mínimos usar para producir una proteína de un patrón de etiquetado uniforme específico?

Qué cepa de algas se utiliza para crear BioExpress® 1000? Agmenelum quadriplicatum.

Qué cepa de algas se utiliza para crear Celtone® Powder y Celtone® Complete media? Chlorella vulgaris.

Cuál es la diferencia entre BioExpress y Celtone media? Ambos medios son similares, pero como se derivan de dos cepas de algas diferentes, tienen ligeras diferencias. Para saber cuál funciona mejor para una proteína particular de interés, se recomienda realizar primero un pequeño experimento de prueba.

Qué cepa de algas se utiliza para crear el producto Amino Acid Mixes? Agmenelum quadriplicatum.

Qué cepa de algas es el producto Whole Algal Cells? Agmenelum quadriplicatum.

Ejemplos de referencias

Otten, R.; Chu, B.; Krewulak, K.D.; et al. 2010. Comprehensive and cost-effective NMR spectroscopy of methyl groups in large proteins. J Am Chem Soc, 132(9), 2952-2960. PMID: 20148553 
Studier, F. W. 2005. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures. Protein Expr Purif, 41(1), 207-234. PMID: 15915565
Tyler, R.C.; Sreenath, H.K.; Singh, S.; et al. 2005. Auto-induction medium for the production of [U-15N]- and [U-13C, U-15N]-labeled proteins for NMR screening and structure determination. Protein Expr Purif, 40(2), 268-278. PMID: 15766868